CircRNA鑒定及研究方法
環(huán)狀RNA（Circular RNA，縮寫為CircRNA）屬于非編碼RNA（non-coding RNA, ncRNA），是近些年新興的一個(gè)重要研究熱點(diǎn)。CircRNA是一類不具有5'端帽子和3'端poly(A)結(jié)構(gòu)，并且以共價(jià)鍵形成環(huán)狀分子結(jié)構(gòu)的RNA分子（圖1）。CircRNA主要是通過(guò)反向剪接（back-splicing）的方式產(chǎn)生，明顯不同于線性RNA（linear RNA）經(jīng)典的5'–3'的模式。
每一個(gè)研究熱點(diǎn)背后都有它的背景故事，從不被認(rèn)知到受到廣泛的親賴。下面，就讓我們一起看一下CircRNA的發(fā)現(xiàn)史。
CircRNA發(fā)現(xiàn)史
◆ 1976年，美國(guó)農(nóng)業(yè)部的科研工作者在馬鈴薯紡錘塊莖病的研究中發(fā)現(xiàn)類病毒（Viroids）能侵染植株并導(dǎo)致死亡。但與常規(guī)病毒不同的是，發(fā)現(xiàn)的類病毒并沒有蛋白質(zhì)外殼包被，核酸是單鏈、閉合、RNA分子。
◆ 1979年，洛克菲勒大學(xué)的Hsu和Coca-Prados，用電子顯微鏡在真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中觀測(cè)到環(huán)狀RNA的存在，這為CircRNA存在提供了最直接的證據(jù)。
◆ 1991年，Nigro在HCT116等人源細(xì)胞DCC基因中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的CircRNA。
◆ 1993年，Capel在成年小鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)精子決定基因Sry中存在CircRNA的轉(zhuǎn)錄。
◆ 2006年，Houseley在果蠅中發(fā)現(xiàn)來(lái)自于Muscleblind基因的未知環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本。
◆ 2012年，Salzman通過(guò)RNA-Seq方法首次報(bào)道了大約80個(gè)環(huán)狀RNA分子。至此借助于高通量測(cè)序技術(shù)，環(huán)狀RNA的研究，正式開始大量進(jìn)入人們的視野。
◆ 2013年，Nature雜志兩篇重要的研究論文揭示出一些環(huán)狀RNA充當(dāng)分子“海綿”，結(jié)合并封閉了microRNAs。自此，環(huán)狀RNA在科學(xué)界受到了前所未有的關(guān)注。
隨著環(huán)狀RNA功能、作用被逐步揭開，環(huán)狀RNA的研究也越來(lái)越受到重視。接下來(lái)，就讓我們從CircRNA的分類、作用、鑒定方法和研究方法四個(gè)方面，詳細(xì)的了解下circRNA。
CircRNA的分類
CircRNA在各種動(dòng)物、植物、昆蟲和真菌等均有發(fā)現(xiàn)。到目前為止，主要發(fā)現(xiàn)了大約183000種人源circRNA，96000種猴源circRNA和82000種鼠源circRNA[1]。與mRNA等線性RNA相比，circRNA在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)量較少，但表達(dá)模式卻與其線性同源RNA不同，其表達(dá)不依賴于其同源的線性RNA。
CircRNA按照含有的外顯子和內(nèi)含子模式的不同，主要可以分為以下四類：
1) 單外顯子circRNA，single exon circRNA；
2) 多外顯子circRNA，multi-exon circRNA；
3) 外顯子和內(nèi)含子共存的circRNA，exon-intron circRNA；
4) 內(nèi)含子circRNA，intronic circRNA；
CircRNA的作用
? 作為miRNA的sponge/decoy（海綿）
例如：在哺乳動(dòng)物的大腦中富含的CDR1as（也稱作ciRS-7）包含有70多個(gè)miR-7的保守結(jié)合位點(diǎn)，在人源細(xì)胞系中減少CDR1as的表達(dá)，可以顯著的減少包含有miR-7結(jié)合位點(diǎn)mRNA在細(xì)胞中的含量[6]。
? 作為RBP（RNA Bingding Protein）的sponge/scafford（海綿）
例如：與動(dòng)脈粥樣化疾病相關(guān)的CircANRIL，通過(guò)結(jié)合核糖體60S亞單元組裝因子，來(lái)抑制血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中核糖體的形成，從而造成動(dòng)脈粥樣化的壓力和細(xì)胞死亡[7]。
? 參與蛋白的翻譯或其本身被翻譯
例如：Circ-ZNF609可以不依賴于剪接和加帽而翻譯成蛋白，產(chǎn)生的蛋白在肌肉分化中起到一定的作用[8]。
? 調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄
例如：擬南芥中，SEPALLATA3（也稱SEP3）是在花的同源異形表型中所必須的，而CircSEP3可以調(diào)控SEP3基因的剪切。CircSEP3來(lái)源于SEP3的外顯子6，并與之形成了一個(gè)RNA-DNA的雜合鏈，這導(dǎo)致了外顯子6的轉(zhuǎn)錄終止，從而發(fā)生了外顯子跳躍，導(dǎo)致產(chǎn)生了一個(gè)新的SEP3的mRNA剪切體[9]。
? 腫瘤發(fā)生的調(diào)控
例如：HPV（human papillomavirus）會(huì)產(chǎn)生包含有致癌性E7基因的CircE7，其中HPV-16產(chǎn)生的CircE7會(huì)翻譯生成E7致癌蛋白。在CaSki宮頸癌細(xì)胞中，減少CircE7含量會(huì)導(dǎo)致E7蛋白的減少，并且會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，這項(xiàng)結(jié)果在細(xì)胞水平上和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都得到了驗(yàn)證[10]。
? 神經(jīng)調(diào)控
例如：對(duì)正常個(gè)體和患有阿爾茨海默氏病個(gè)體的頂葉皮層組織進(jìn)行RNA-Seq分析顯示，CircRNA的表達(dá)量在早期的時(shí)候就有明顯的變化，而且這種變化獨(dú)立于其來(lái)源的線性RNA的表達(dá)[11]。
CircRNA還可能在免疫、發(fā)育等過(guò)程中起到重要的作用。
CircRNA的鑒定方法
RNase R消化檢測(cè)
RNase R是一種來(lái)源于大腸桿菌的核酸外切酶，它可以沿RNA的3’-5’方向切割、降解RNA，能夠消化幾乎所有的線性RNA分子，但不易消化呈環(huán)形的RNA、套索結(jié)構(gòu)或3’端突出末端少于7 nt的雙鏈RNA分子（圖4）。
RNase R檢測(cè)并非是必須的，但可以作為一個(gè)很典型的實(shí)驗(yàn)證明和鑒定circRNA。RNase R主要用于circRNA的鑒定和富集實(shí)驗(yàn)，需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和目的決定是否進(jìn)行RNase R消化。
RNase R并不是絕對(duì)的不能消化circRNA，消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、RNase R的用量過(guò)高都有可能會(huì)導(dǎo)致在酶消化后CircRNA的含量也有明顯降低（圖5），所以在使用RNase R進(jìn)行消化時(shí)，還要進(jìn)行相應(yīng)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置好相應(yīng)的對(duì)照，看是否對(duì)于所要研究的CircRNA有明顯的影響，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
qPCR檢測(cè)
qPCR檢測(cè)通過(guò)引物特異性和位點(diǎn)設(shè)計(jì)來(lái)保證所檢測(cè)的為環(huán)狀RNA，一般多用于高通量測(cè)序后的數(shù)據(jù)驗(yàn)證及后續(xù)功能研究的定量檢測(cè)（圖6）。Convergent引物作為參照，不管是基因組或線性RNA還是環(huán)狀RNA均可擴(kuò)增，而Divergent引物只有環(huán)狀RNA可以被擴(kuò)增出來(lái)。
如果是以qPCR進(jìn)行定量檢測(cè)，一般可以不做RNase R檢測(cè)，即不需要對(duì)circRNA進(jìn)行富集（線性RNA被消化）。
RNA-Seq檢測(cè)
CircRNA可以通過(guò)RNA-seq技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的鑒定，由于CircRNA在總RNA的含量占比比較低，為了增加CircRNA的檢出種類和檢出效果，一般會(huì)對(duì)CircRNA進(jìn)行富集。富集的方法有很多種，大體上的原理都是通過(guò)技術(shù)手段去掉總RNA中不需要的RNA來(lái)達(dá)到富集的目的，比如使用RNase R消化總RNA、使用探針結(jié)合并去除核糖體RNA等。
進(jìn)行RNA測(cè)序后，就可以使用生物信息學(xué)工具或方法在全基因組范圍內(nèi)鑒定circRNA。目前基于RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定circRNA的方法主要是通過(guò)檢測(cè)是否有read能匹配到back-splicing junction (BSJ) site來(lái)判斷，即circRNA的首和尾連接處的序列。
CircRNA的研究方法
隨著對(duì)CircRNA的了解，研究方法也在不斷的成熟。這里我們?yōu)榇蠹艺砹私陙?lái)的CircRNA的研究方法，供大家參考[1]
相關(guān)產(chǎn)品推薦
參考文獻(xiàn)
[1] The expanding regulatory mechanisms and cellular functions of circular RNAs. Molecular Cell Biology.
[2] Electron microscopic evidence for the circular form of RNA in the cytoplasm of eukaryotic cells.Nature.
[3] Circular RNAs: Biogenesis, Function and Role in Human Diseases. Frontiers in Molecular Biosciences.
[4] Circular RNAs in the Mammalian Brain Are Highly Abundant, Conserved, and Dynamically Expressed. Molecular Cell.
[5] Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.Nature.
[6] Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature.
[7] Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF- associated non- coding RNA correlates with atherosclerosis risk. PLoS Genet.
[8] Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Mol. Cell
[9] A circRNA from SEPALLATA3 regulates splicing of its cognate mRNA through R-loop formation. Nat. Plants.
[10] Transforming activity of an oncoproteinencoding circular RNA from human papillomavirus. Nat. Commun.
[11] An atlas of cortical circular RNA expression in Alzheimer disease brains demonstrates clinical and pathological associations. Nat. Neurosci.
