2024 諾貝爾生理學或醫學獎：microRNA 開啟基因調控新維度
2024 年諾貝爾生理學或醫學獎的頒布，再次吸引了全球科學界的目光。今年，這一殊榮授予了兩位科學家：Victor Ambros和Gary Ruvkun，他們因發現microRNA及其在基因轉錄后調控的作用，獲得2024年諾貝爾生理學或醫學獎。
圖1 2024年諾貝爾生理學或醫學獎獲獎者，Victor Ambros和Gary Ruvkun
microRNA 的發現過程
故事要從 20 世紀 80 年代末說起，Ambros和Ruvkun一直在研究秀麗隱桿線蟲（現在都已成為模式生物了）的生命進程，他們將目標鎖定在了兩個突變株 “lin-4” 和 “lin-14”上。Ambros驚奇地發現，lin-4 基因仿佛是 lin-14 基因的神秘 “負調控者”，但其中的抑制機制卻如同籠罩在一層迷霧之中，讓人捉摸不透。
時光流轉，Ambros直到博士后生涯結束，才在哈佛大學的實驗室里意外迎來了重大突破。他發現，lin-4 基因抑制 lin-14 基因的原因，極有可能是 lin-4 產生的一種超短 RNA。與此同時，Ruvkun也有了驚人發現，他察覺到 lin-4 并不影響 lin-14 基因產生mRNA，而是阻止 mRNA 產生蛋白質。并且，他還找到了 lin-14轉錄mRNA 上的一個關鍵位置，這個位置就是 lin-4 對其進行抑制的結合位點。
當Ambros和Ruvkun交流彼此的發現后，一個具有突破性的結論誕生了：lin-4 中的超短 RNA 與 lin-14 中 mRNA 的關鍵片段序列互補，正是通過這種奇妙的結合，超短 RNA 如同一個“開關”，“關閉”了 lin-14基因的表達，阻止它產生蛋白質。這一發現，揭開了以前從未被知曉的、基于 microRNA 的基因調控機制。因為在此之前，科學家們一直認為是一種名為 “轉錄因子” 的特殊蛋白質，通過與 DNA 的特定區域結合，來決定產生哪些 mRNA，從而實現基因調控。
圖2 Ambros和Ruvkun發現lin-4來源的microRNA過程
限于當時的環境和人們的認知，他們的發現之路并非一帆風順。1993 年，當Ambros和Ruvkun在《Cell》雜志上發表這一創新成果時，卻并沒有引起科學界過多的關注。盡管這是前所未有的重大發現，但科學界卻認為這種機制可能僅僅是秀麗隱桿線蟲的獨特特性，與人類和其他更復雜的動物毫無關系。
但命運的轉折總是充滿戲劇性，2000 年時，當Ruvkun研究小組公布他們發現的另一種由 let-7 基因編碼的 microRNA 時，曾經的沉默瞬間被打破，引起了巨大的轟動。因為與 lin-4 不同，let-7 基因普遍存在于整個動物界。這一驚人發現如同在科學界投下了一顆重磅炸彈，引發了一場激烈的研究熱潮。在接下來的幾年里，數百種不同的 microRNA 被一一鑒定出來。
圖3 Ruvkun克隆了第二個編碼microRNA的基因let-7，該基因在進化中是保守的且普遍存在于整個動物界
如今，人體內超過一千種 microRNA 已被發現。可以毫不夸張地說，沒有它們，細胞和組織就無法正常發育，而它們的異常和突變甚至可能引發癌癥等嚴重疾病。microRNA 的出現，就像是為生命的基因調控世界打開了一扇全新的大門，揭示了一個全新的維度，它對所有復雜的生命形式都至關重要。
圖4 自1993-2000發現microRNA開始的microRNA研究進程
microRNA 的應用
近些年來由于對microRNA研究的比較多，我們知道microRNA 是一類由內源基因編碼的長度約為 22 個核苷酸的非編碼單鏈 RNA 分子。它通過與靶 mRNA 結合，抑制其翻譯或促進其降解，從而在轉錄后水平調控基因表達。
圖5 microRNA的開創性發現揭示了基因調控的一個新維度
醫學領域
在醫學領域，microRNA 展現出了巨大的潛力，可作為疾病的重要生物標志物。例如，眾多研究已表明，在某些癌癥中，特定的 microRNA 表達水平會發生顯著變化。Lan 等人在權威期刊《Biomedical Research International》發表的論文中深入探討并強調了 microRNA 作為癌癥潛在生物標志物的重大意義。以肝癌為例，大量研究發現，在不同類型的癌癥（肺癌、肝癌、結直腸癌等）患者中，不同的microRNA的表達水平有非常明顯的變化。通過對血液中microRNA含量的精準檢測，能夠為癌癥的早期診斷提供極為重要的參考依據。
同時，microRNA 為疾病治療開辟了新的策略。Krützfeldt 等人在國際著名期刊《Nature》發表的研究中，創新性地介紹了 “antagomirs” 這種反義寡核苷酸，它可在體內有效地沉默 microRNA。通過使用特定的 microRNA 模擬物或抑制劑，可以精準地調節相關基因的表達，進而為疾病治療帶來新的希望。在一些癌癥的治療研究中，科學家們積極探索使用 microRNA 抑制劑來抑制腫瘤細胞的生長和擴散。例如，針對某些特定類型的癌癥，研究人員發現特定的 microRNA 抑制劑能夠靶向作用于腫瘤細胞中的關鍵基因，從而抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，為癌癥治療提供了新的思路和方法。
農業領域
在農業領域，microRNA 在植物的生長發育和抗逆性中起著至關重要的作用。Tang 和 Chu 在《Nature Plants》發表的文章中，系統地強調了 microRNA 在作物復雜性狀改良中的重要意義。通過調控植物中的 microRNA 表達，可以有效地改良農作物的品質和產量。比如，在面對干旱、鹽堿等不良環境時，調節與植物抗逆性相關的 microRNA，可以顯著提高農作物的耐受性。此外，還可以利用 microRNA 技術來培育具有特定性狀的轉基因農作物。Zhou 和 Luo 的研究深入探討了 microRNA 介導的基因調控在植物基因工程中的潛在應用。通過對特定 microRNA 的調控，可以實現對農作物生長發育過程的精準干預，培育出具有高產、優質、抗逆等優良性狀的農作物品種，為農業生產的可持續發展提供了新的技術手段。
研究方法
那么如何研究 microRNA 呢？ 常用的實驗方法和技術手段也是豐富多樣的，下面跟大家介紹一些常用的實驗研究方法。
① Northern Blot
這是一種經典的 RNA 檢測方法。通過電泳將 RNA 分離，然后將其轉移到膜上，利用特定的 microRNA 探針進行雜交，檢測 microRNA 的表達水平。雖然該方法相對較為繁瑣，但具有較高的特異性和準確性。
圖6 Northern Blot檢測的靈敏度和準確性
② 基因芯片技術
這是一種高通量的檢測方法，可以同時檢測大量 microRNA 的表達水平。通過將已知的 microRNA 探針固定在芯片上，與樣本中的 microRNA 進行雜交，然后利用熒光或其他信號檢測技術，快速獲取樣本中 microRNA 的表達譜。這種方法能夠全面地了解不同生理或病理狀態下 microRNA 的變化情況，為研究 microRNA 的功能提供重要線索。這種方法成本較高；可能存在假陽性和假陰性結果；對樣本的質量和數量要求較高。
③ 實時定量 PCR（RT-qPCR）
該方法可用于特定 microRNA 的定量分析。它具有高靈敏度和特異性，能夠準確地檢測出微量的 microRNA。通過設計針對特定 microRNA 的引物和探針，利用 PCR 技術對 microRNA 進行擴增，并實時監測擴增過程中的熒光信號變化，從而計算出 microRNA 的相對或絕對表達量。由于其操作相對方便，方法簡單，通量高，已經成為實驗室里面常用的一種檢測microRNA的方法了。
這種方法首先要把 RNA 提取出來，microRNA 的 qPCR 的檢測與正常的基因無明顯差異，但由于 microRNA 比較小，所以需要的特殊的反轉錄方法。常用的反轉錄方法有兩種，一種為莖環法（Stemloop specific primer），一種為加尾法（Universal primer）。
圖7 microRNA常見的2種反轉錄的方式
④ RNA 干擾技術
這是一種研究 microRNA 功能的有力工具。通過導入特定的小干擾 RNA（siRNA）或 microRNA 抑制劑，可以特異性地抑制目標 microRNA 的功能。相反，使用 microRNA 模擬物可以增強 microRNA 的活性。通過觀察細胞或生物體在 microRNA 功能改變后的表型變化，可以推斷出 microRNA 的生物學功能。
⑤ 生物信息學分析
隨著高通量測序技術的發展，產生了大量的 microRNA 序列數據。生物信息學方法可以用于分析這些數據，預測新的 microRNA、識別 microRNA 的靶基因以及研究 microRNA 的進化和功能保守性。例如，利用序列比對算法，可以在不同物種中尋找保守的 microRNA，從而揭示 microRNA 在進化過程中的重要作用。
⑥ 細胞和動物模型實驗
構建細胞和動物模型是研究 microRNA 功能的重要手段。通過在細胞系中過表達或抑制特定的 microRNA，可以觀察細胞的增殖、分化、凋亡等生物學過程的變化。在動物模型中，可以通過基因敲除、轉基因等技術來研究 microRNA 在體內的功能。例如，構建 microRNA 敲除小鼠模型，可以研究特定 microRNA 在小鼠發育、生理和疾病中的作用。
圖8 整體原位microRNA 雜交（Whole-mount miRNA ISH）技術在生物發育中的應用
⑦ microRNA 活性檢測方法
? 報告基因法：構建含有 microRNA 靶序列和報告基因（如熒光素酶基因）的載體，當 microRNA 與靶序列結合時，會抑制報告基因的表達。通過檢測報告基因的活性變化，可以間接反映 microRNA 的活性。其中熒光素酶報告系統由于操作簡單、靈敏度高，已廣泛的應用于microRNA的活性及靶標檢測。更詳細的方法可以參看下方的視頻。
復制下方鏈接，可查看完整視頻
http://www.bazhou0316.com/technology_video.html
? Western blot 檢測靶蛋白法：microRNA 通過與靶 mRNA 結合抑制其翻譯，從而降低靶蛋白的表達水平。通過 Western blot 技術檢測靶蛋白的表達量變化，可以推斷 microRNA 的活性。
? RNA 結合蛋白免疫沉淀法（RIP）：利用抗體特異性地結合與 microRNA 結合的 RNA 結合蛋白，然后通過免疫沉淀分離出與該蛋白結合的 RNA，包括 microRNA 和其靶 mRNA。通過檢測沉淀下來的 RNA 中 microRNA 和靶 mRNA 的含量，可以分析 microRNA 的活性及其與靶 mRNA 的結合情況。
TransGen 相關產品
小 RNA 提取試劑盒 (ER601)
產品特點
★ 操作安全性提高：使用 RNA Extraction Agent 替代了氯仿
★ 適用于從細胞、組織、新鮮血液、外泌體中提取 miRNA 和 Total RNA
★ 通過調整加入水相中無水乙醇的用量，可獲得：
1. RNA 離心柱吸附大分子量 RNA(28S rRNA, 18S rRNA, mRNA) 后，將流出液 ( 包含小于 200 nt 的 RNAs, 如 miRNA,siRNA, shRNA, snRNA 等 ) 再經 miRNA 離心柱吸附 Small RNA；
2. RNA 離心柱吸附所有 RNA( 包含小于 200 nt 的 RNA)
★ 裂解能力強、提取量高、應用范圍廣
數據展示
分別用 miRNA 提取產品提取 miRNA，2 個重復，用 miRNA 反轉錄產品反轉后進行 qPCR 檢測
強化 RNA 提取試劑盒 (ET111)
產品特點
與其它總 RNA 提取試劑相比，裂解能力強、速度快，RNA 的提取量與純度更高。
? 操作安全性提高：使用 RNA Extraction Agent 替代了氯仿
? 適用于快速提取多種組織和細胞中的總 RNA
? 應用范圍廣：動物、植物組織、血液和細菌等樣品。小量樣品 (50-100 mg 組織、5×106 細胞、200 μL 血液 )。大量樣品 ( ≥1 g 組織或 ≥107 細胞 )
? 提取速度快：一個小時內可完成反應
? 操作可視化：溶液呈粉紅色，便于分離水相和有機相
? 提取純度高：DNA 和蛋白質的污染低
? RNA 溶解液：便于 RNA 保存和降低對反轉錄反應的抑制
數據展示
TransScript? miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix
TransScript miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒 (AT351)
產品特點
★ 適用于 Total RNA 或 small RNA 等包含 miRNA 的樣品反轉錄
★ 優化的加尾酶和反轉錄酶配比及反應緩沖液，確保 miRNA 的反轉錄效率
★ Poly(A) 加尾和 cDNA 合成在同一反應體系中一步完成
數據展示
? 批次間穩定性好
使用不同批次產品分別以從人血漿中提取的 miRNA 為模板，進行 qRT-PCR 檢測，根據 Cq 值變化判斷該產品批次間的穩定性。
? 反轉錄效率高
使用 TransGen 和 Company TA 產品，分別以從人血漿中提取的miRNA 為模板，進行 qRT-PCR 檢測，根據 Cq 值變化分析反轉錄效果。
TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix
TransScript 一步法 gDNA 去除及 cDNA 合成試劑盒 (AT311)
產品特點
★ 在同一反應體系中，同時完成反轉錄與基因組 DNA 的去除，操作簡便，降低污染幾率
★ 產物用于 qPCR：反轉錄 15 分鐘；產物用于 PCR：反轉錄 30 分鐘
★ 反應結束后，同時熱失活 RT/RI 與 gDNA Remover
★ 合成片段 ≤12 kb
數據展示
? 反轉錄效率高
? 高效基因組去除
使用不同批次產品分別以人 100 ng 總 RNA、人 100 ng 總 RNA+200 ng gDNA、200 ng gDNA 為模板，進行 RT-PCR 檢測，1.0% 瓊脂糖凝膠電泳分析模板 DNA 去除效果；qRT-PCR 檢測 18S DNA 表達量。
PerfectStart? Green qPCR SuperMix
染料法熒光定量預混試劑（AQ601）
產品特點
★ 3 種抗體封閉，特異性高，靈敏度高，擴增效率強，適用物種范圍廣
★ 雙陽離子緩沖液，增強特異性，減少引物二聚體形成，數據準確
★ 配有適用于不同機型的 Universal Passive Reference Dye ( 調整 PCR 加樣誤差引起的管間差異 )，校正孔間信號誤差
數據展示
? 擴增效率高
以梯度稀釋的質粒 DNA (10 ng ～ 0.1 pg，10 倍稀釋 ) 為模板進行擴增得到的擴增曲線和標準曲線。結果顯示，TransGen 產品擴增效率較高，可得到漂亮的擴增曲線和標準曲線。
? 不同物種模板擴增
以不同物種的 RNA 反轉錄 (TransGen, AT311) 后得到的 cDNA 為模板分別使用 TransGen 與 Company T 的產品進行擴增 (NTC 無擴增 )。結果顯示，TransGen 產品擴增效果與 Company T 產品基本一致。
產品信息
精選文獻
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展望
對 microRNA 的未來研究充滿期待。在研究方向上，科學家們將進一步深入探索 microRNA 在不同生理和病理過程中的作用機制，以及與其他基因調控因子的相互關系。在疾病治療方面，有望開發出基于 microRNA 的新型藥物，為癌癥等嚴重疾病的治療帶來新的突破。同時，隨著技術的不斷進步，對 microRNA 的檢測和調控方法也將更加精準和高效。
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